光合细菌的培养方法

一、培养方式

光合细菌的大量培养通常采用全封闭式厌气光照培养和开放式微气光照培养两种方式。

(一)全封闭式厌气光照培养

全封闭式厌气光照培养是采用无色透明的玻璃容器或塑料薄膜袋,消毒后装入消毒好的培养液,接入20%~50%的菌种母液,使整个容器均被液体充满,加盖(或扎紧接口),

造成厌气的培养环境,置于有阳光的地方或用人工光源进行培养,定时搅动,在适宜的温度下,一般经过5~10天的培养,即可达到指数生长期高峰,此时可采收或进一步扩大培养。

(二)开放式微气光照培养

开放式微气光照培养一般采用容量为l00~200升的塑料桶为培养容器。在桶底部装一气石,培养时微充气、使桶内的光合细菌呈上下缓慢翻动。在桶的正上方距捅面30厘米左有装一有罩的白炽灯泡,使被面照度达2000 lx左右。培养前先把容器消毒,加入消毒好的培养液,接入20%~50%的菌种母液,照明,微充气培养。在适宜的温度下,一般经7~10天的培养,即可达到指数生长期高峰,此时,进行采收或近一步扩大培养。

两种培养方式相比,以厌气培养方式较为理想,微气培养方式虽然设备比较简单,易于大量培养,但杂菌污染程度大,培养达到的菌细胞密度低。

二、菌种分离、保藏

培养光合细菌首先要有菌种。目前,应用于水产养殖业的光合细菌,主要是红螺菌科即紫色非硫细菌中的一些种类。它们共同的特征是具鞭毛,能运动,不产生气泡,细胞内不积累硫磺。光合细菌分离成功的关键在于选择适宜的富集、分离培养基,和提供适于光合细菌生长需要的厌气环境及适宜的温度、光照条件。

(一)采样

红螺菌科细菌可用有机物作为光合作用的供氢体兼碳源,广泛分布在被有机物污染的地方,如河底、湖底、海底、水田、沟渠和污水塘的泥土以及豆制品厂、淀粉厂和食品工业

等废水排水沟处呈橙黄色或粉红色的泥土中。浅水处直接用杯舀取少量泥土作样品,深水处借用采水器和采泥器采样。

(二)富集培养

富集培养均采用液体培养基。将采回的样品(土壤或水)装入玻璃圆筒或大型试管或具塞的磨口玻璃瓶中,倒入配制好的培养液,充分搅拌。为造成厌气环境,在玻璃圆筒或大型

试管中加入液体石蜡以隔断空气。然后在温度为25~35℃,光照为5000~10000 lx的条件下进行富集培养,经过2~8周的培养,在玻璃瓶壁上出现光合细菌菌落,或整个培养液长成红色。如果培养的光合细菌是海水种,因其生长缓慢则需要更长的富集时间。

如果富集培养初步获得成功,就用吸管插入菌液中或光合细菌大量繁殖的泥层中,将菌液吸入具塞的磨口玻璃瓶中,加入培养液继续进行光照;厌气培养。反复多次后,光合细菌

压倒其他细菌而占绝对优势,培养液吴深红色.这时富集培养成功。为了避免培养液中藻类和绿杆菌科细菌的生长繁殖,可用滤光片,使波长为800nm或更长波长的光透过,可以更有效地达到富集紫色非硫细菌的目的。

此外,培养紫色非硫细菌时,用含氯化物的培养基比用合硫酸盐的培养基效果好。

(三)分离方法

富集培养成功后可进行分离培养。淡水生长的紫色非硫细菌生长速度较快,在1周左右移植比较合适,而海水生长的紫色非硫细菌生长速度较慢,培养3周以上才能移植。先配制固体培养基,灭菌后浇成平板。将富集培养成功的菌液适当稀释,在平板划线,然后在厌气、光照条件下培养。培养温度为25~35℃,光照为2000~3000 lx,培养2~7天左右,就能长出光合细菌菌落。仔细挑取单菌落,继续用上述方法分离培养。反复多次,便能得到紫色非硫细菌的纯培养物。

三、培养方法
光合细菌的培养,按次序分为容器、工具的消毒,培养基的制备,接种和培养管理四个步骤。
(一)容器、工具的消毒
参考微藻培养方法部分,此处从略。
(二)培养基的制备
1.培养用水
如果培养的光合细菌是淡水种,菌种培养可用蒸馏水,生产培养可用消毒的自来水(或井水)配制。如果培养的光合细菌是海水种,则用天然海水配制培养基,注意在海水中加入磷元素时,不能用磷酸氢二钾,应用磷酸二氢钾,不然会产生大量沉淀。
2.灭菌和消毒
菌种培养用的培养基应连同培养容器用高压蒸气灭菌锅灭菌。小型生产性培养可把配好的培养液用普通铝锅或大型三角烧瓶煮沸消毒。大型生产性培养则把经沉淀砂滤后的水用漂白粉(或漂白液)消毒后使用(具体方法参考微藻培养方法部分)。
3.培养基配制
根据所培养种类的营养需要选择合适的培养基配方。按培养基配方把所需物质称量,逐一溶解,混合,配成培养基。也可先配成母液,使用时按比例加入一定的量即可。
(三)接种
培养基配好后,应立即进行接种。光合细菌生产性培养的按种量比较高,一般为20%~50%,即菌种母液量和新配培养液虽之比为1∶4~1∶1,不应低于20%,尤其是微气培养,接种量更应高些,否则光合细菌在培养液中很难占绝对优势,影响培养的最终产量和质量。
(四)培养管理
光合细菌的培养过程中,管理工作包括日常管理操作和测试,生长情况的观察、检查以及出现问题的分析处理等三个方面。
1.日常管理和测试
(1)搅拌和充气:光合细菌培养过程中必须充气或搅拌,作用是帮助沉淀的光合细菌上浮获得光照,保持菌细胞的良好生长。
小型厌气培养常用人工摇动培养容器的方法使菌细胞上浮,每天至少摇动三次,定时进行。大型厌气培养则用机械搅拌器或使用小水泵使水缓慢循环运转,保持菌体悬浮。微气培养是通过充气帮助菌体上浮,因为培养液中溶解氧含量增加,光合细菌繁殖受到抑制,产量下降,所以必须严格控制充气量。一般采用定时断续充气,充气量控制在1~1.5升/(升•h)之间,溶解氧量保持在1×10-6以下。
(2)调节光照度:培养光合细菌需要连续进行照明。在日常管理工作中,应根据需要经常调整光照度。白天可利用太阳光培养,晚上则需要人工光源照明,或完全利用人工光源培养。人工光源一般使用碘钨灯或白炽灯泡。不同的培养方式所要求的光照强度有所不同。一般培养光照强度应控制在2000~5000 lx之间。如果光合细菌生长繁殖快,细胞密度高,则光照强度应提高到5000~10000 lx。光照强度可通过调整培养容器与光源的距离或使用可控电源箱调节。
(3)调节温度:光合细菌对温度的适应范围很广,一船在23~39℃的范围内均能正常生长繁殖,可不必调整温度。在常温下培养也可通过调整,将温度控制在光合细菌生长繁殖最适宜的范围内,使光合细菌更好地生长。
(4)酸碱度的测定和调整:在培养光合细菌的过程中,必须注意酸碱度的变化。由于光合细菌的大量繁殖,菌液的pH值上升,这意味着光合细菌正处于指数生长期。但当pH值超过最适范围甚至生长的适应范围时,光合细菌的生长达到顶点,随后生长下降。如果能及时调整菌液的酸碱度,使pH值保持在最适范围,则光合细菌能继续生长繁殖。为了延长光合细菌的指数生长期,提高培养基的利用率和单位水体的产量,测定和调整PH值是非常重要的。一船采用加酸的办法来降低菌液的酸碱度,醋酸、乳酸和盐酸部可使用,最常用的是醋酸。
在日常的管理工作中,必须每天或隔天测定菌液的pH值,当pH值上升超出最适范围,即加酸调整。如果在培养过程中不测定、调整酸碱度,当光合细菌的生长达到一定密度后pH值也上升到9以上,细菌生长受阻,此时应采收或再扩大培养。在培养过程中不调整PH值,获得的最终产量低。
2.生长情况的观察和检查
光合细菌生长情况的好坏是培养成败的标准。在培养过程中,可以通过观察菌液的颜色及其变化来了解光合细菌生长繁殖的大体情况,菌液的颜色是否正常,接种后颜色是否由浅变深,均反映光合细菌是否正常生长繁殖以及繁殖速度的快慢。必要时可通过显微镜检查,了解情况。
3.问题的分析和处理
通过日常管理、检测、检查,了解光合细菌的生长情况,就可以结合当时环境条件的变化进行分析,找出影响光合细菌生长繁殖的原因,采取相应的措施。影响光合细菌生长的原因很多,内因是菌种是否优良,外因是光照、温度、营养、敌害和厌气程度等。温度、光照和pH值都能影响着光合细菌的生长,而且温度、光照和pH值之间是互相制约的,温度与光照的强弱是对立统一的,所以光合细菌生长的最适条件应是互应的,即温度高,光照应弱;温度低,光照应强。如果是温度高,光照强,pH值就会迅速升高,培养基产生沉淀,抑制光台细菌的生长;如果温度低,光照弱,光合细菌得不到最佳能源,生长速度也慢。经试验得出光合细菌生长的最适条件是:①温度15~20℃时,光照30000~50000 lx,培养基pH值为7.0;②温度25~30℃时,光照为3000~5000 lx,培养基的pH值为7.0。

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