1、藻类检测和计数新方法——置式显微镜法

由于环境污染，一些湖泊富营养化程度不断加剧，导致水中藻类的快速增长。大量藻类的存在，直接影响了自来水的生产和供应。为了了解藻类对水厂各工艺环节的影响，以湖泊水为水源的许多水厂都相继开展了藻类计数检测项目。国内普遍采用的方法是将1L水样加鲁戈试剂固定在一个容器中，自然沉降24h后，利用虹吸的方法吸去上清液，并浓缩定容到30～50mL，然后取1mL放入血球计数板，在正置式显微镜下进行镜检计数[1]。此方法由于所需的水样较多（1L），在需要采集多个水样时，采集和运送的工作量大;在沉样时还要多次冲洗转移，增加了产生误差的机会，而且操作不便。昆明自来水总公司的水源之一是富化程度较高的滇池水，因而昆明水司较早开展了此项目，并得到了瑞士苏黎世供水局的技术支持和大力帮助。我们所采用的藻类计数方法的特点是使用倒置式显微镜，藻样通过沉样板一步沉降到位，与国内普遍采用的方法相比具有准确快捷，水样用量少，运送方便，无须多次冲洗转移，操作简单等优点，适用于生产和科研检测。

1.用品准备

（1）沉样板。由一个长12cm，宽4.1cm,中央有圆形凹槽（底面积为5cm2）的长方形有机玻璃板和一个可滑动的、底部与凹槽形状完全吻合的空心圆筒（容积为25mL）以及一块圆形盖玻片组成（见图1），有机玻璃板的左侧有一小孔，用于放掉上清液。

（2）倒置式显微镜。与普通倒置式显微镜不同的是，它的载物台经简单改造，增加了一个长方形的金属框，大小恰好可放置沉样板。金属框的作用是将沉样板固定在载物台上，使沉样板可与载物台同步移动，避免沉样板发生偏移。两个目镜，一个装有微型刻度尺，可直接测量藻类的大小和长度，另一个装有“  ”形标尺，在讦数时用它界定讦数范围。

（3）250mL试剂瓶。用于盛装水样。

（4）移液管（1～25mL）。

2.药品准备

①鲁戈试剂（Lugols Solution）;②福尔马林（40%）;③洒精（50％）。

3.方法与步骤

3.1取样

先在250mL试剂中加入6～7滴鲁戈剂，再加入200mL，左右水样，摇匀。如果水样需保存较长时间，可加入适量福尔马林（40％）。

3.2沉降

用移液管取适量水样加入沉样板，再加入蒸馏水至满，加盖圆玻片，静沉24h。取多少水样，同藻类的多寡而定，藻类数量多可少取，数量少可多取，一般水样体积在1~25mL之间。

3.3计数

将沉样板上的圆筒用盖玻片推开，放掉上清液，置于显微镜上，以目镜上的“工工”形标尺为界线，随机选取若干条带计数。

一般情况是这样计数的；①在10×16倍镜头下，计数全部视野（1cm2）内的大型藻类。②在×25的倍镜下，随机选取5条带，计数基中的中型藻类。③在10×40倍的镜头下，随机选取1条带，计数其中的微型藻类。

在实际运用中，可根据当地的原水藻类情况，确定所选取的条带数。

3.4计算

N= 

式中N ——1mL;

5——沉样板板底部圆形凹槽的底面积，cm2;

S——每个计数条带的面积，cm2;

A——选取的条带数；

V——水样体积；mL;

N——实际数的A个条带的藻类个数。

将上述三个放大倍数下计数得的藻类依上式分别计算，再相加，即得到藻类总数。

3.5清洗

计数完毕，用蒸留水冲洗沉样板，浸泡于50％的酒精中过认，再次用蒸留水冲洗后，晾干待用。

4.注意事项

（1）沉样前，要将水样摇匀

（2）将沉样板的圆筒推开时，要防止产生气泡。

（3）将沉样板置于显微镜上时，要尽量保持平衡，避免藻类向一侧倾斜。

（4）在选取计条带时，既要注意随机性，又要注意均匀性。

5.实际样品检测

取某水厂原水用上述方法（简称倒置法）和国内普遍采用的传统方法（简称正置法）分别进行藻类检测和计数，结果见表1。

由表1可见，倒置法水样用量少，并有较高的精密度；正置法水样用量多，精密度较低，而且由于正置法使用的血球计数的容积所限（0.1m3），出现在计数框内的藻类种类也有限，如果需要分类计数，有一定局限性，不好操作。倒置法可以一边分类鉴定，一边分类计数，水样中存在的种类在1cm2的计数范围内基本都能看到，分类鉴定和计数的结果比较全面，操作也方便。另外，倒置法将水样一步沉降到位，省略了许多中间环节，减少了多次冲洗 转移带来的操作误差，从而提高了准确度。

6结论

利用倒置式显微镜进行藻类检测和计数的方法，比使用正置式显微镜的血球计数板法水样用量少，中间环节少，准确快捷，精密度较高，在分类鉴定和计数时，操作较为方便。但该方法使用的沉样板国内尚无厂家生产，需要从国外购买。

二、改进的水中藻类检测方法

水中藻类传统的测定方法是将一定量的水样加鲁哥试剂因定，在筒型分液漏斗中进行自然沉淀，48h后，借助虹吸方法吸去上层清液，按要求浓缩定容到30—50ml，然后在镜下计数，由于固定沉降时间较长，检测结果常滞后于生产和研究，影响了及时分析和解决问题。为了解决这一问题，下文对传统的检测蚊法中的沉淀浓缩进行了改进，摸索出一种快速测定藻类的方法，测定时间缩至当天即可出结果，而且准确、可靠，适用于生产和科研检测。

1测定原理

利用测大肠菌的抽滤装置，对检测水样进行抽滤，藻类被截留在滤膜（0.35—0.65μm）上，利用滤膜对藻细胞的吸附力并不强，用少量纯水在HJ-3型电磁搅拌器上萃取4、5次就能将全部的藻细胞洗回水中。

滤膜的主要成分是硝化纤维素（CN）,可深于丙酮，而丙酮对藻细胞形状基本没影响，当滤膜遇到丙酮后会变成透明胶液，不影响镜下观察检测。

由于丙酮易挥发，滤膜变干会恢复原型，为了保证藻细胞和滤膜的湿度，考虑到丙酮和甘油的相容性，甘油的吸潮性及本身的油脂性，能使藻细胞和滤膜在较长的时间内保持湿润透明，因此，在丙酮溶剂中加了一定比例的甘油，但甘油太多，会影响滤膜的溶解。

2.实验方法

2.1抽滤萃取法

取适量水样，按100：1的量加鲁哥试剂固定，在装有滤膜的抽滤器上进行抽滤。取下滤膜，放到100ml的小烧杯里，有藻细胞的一面朝上，加5—8ml纯水；调好电磁搅拌器转速，使液体搅拌时不会向上溅出，将小烧杯放到搅拌器上转1mim左右，取洗液。

加入纯水5—8ml纯水；重复上步聚；振洗5次，定空洗液至50ml，在显微镜下记数，计算公工：

N=[(A/Ac)×（Vs/V·Va）]×n

式中，N为每升原水样中的浮游植物数量（个·J-1）；A为计数框的体积（ml）；n为计数所得藻类数目（个）。

2.2验证法

将上述实验洗净后的滤膜放入一平面皿，在空调下或热源边（不要超过40℃）使滤膜稍干燥，将滤膜放一载玻片上，加二至四滴滤膜透明液，使膜完全溶解成透明胶液，盖上盖玻片，在CHK型显微镜下观察。

此方法也可用来验证传统沉淀法中的弃液藻细胞流失情况。

3 结果及分析

取已知数量的小球藻9.643×105·1-1，按上述方法进行回收实验，结果见表1，两种方法在实际水样中的应用结果如表2所示。

传统沉淀方法精确度低，平行样相对偏关在+15％；测试时间较长，根据理论推算，最小的藻为沉时间需要60 ，我们实验静置学时间为43H,常有一些较小的藻细胞随弃液流失，而且在南方地区气温较高，藻细胞大都偏小，易发生流失现象，流失达30％以上。

抽滤萃取法能较好地阻止藻细胞流失，但由于滤敢太小，一般只能抽滤浊度10NTU以下的水，对于源水最多只能抽滤200ML左右的水量，太多则滤孔就会被堵 而难以达到抽滤效果，所以存在取水量较少，影响代表性，如有条件，滤膜孔径可取在1.5－1.8M,对于低浊度的出厂水和滤后水，则不存在这个问题，可抽滤200－300ml水量，而且能准确地反映水中残存藻细胞的数量。

传统的沉淀方法中由于染色时间较长，藻细胞和杂质均被染成褐色，在镜下观察时，影响藻细胞的分 而抽滤萃取则没有这种问题，因为藻细胞还保存着很好的原本色泽（绝大多数为绿色）和形状，较容易与水中的细菌、真菌以及低等浮游动物、颗粒、纤维等区分开来。

3、藻类叶绿素及其降解产物的测定方法

下文综述了用分光光度法,荧光检测法及高效液相色谱法测定藻类叶绿素及其降解产物的方法. 分别详细介绍了各种方法的设备,程序,计算公式及特点.。此外,还介绍了藻类类胡萝卜素的高效液相色谱测定方法。 按测定方法分为六个部分：(1) 叶绿素a , b 和c 的分光光度法测定(三色法) ; (2) 叶绿素a 的荧光检测法; (3) 存在脱镁叶绿素a 时叶绿素a 的分光光度法测定; (4) 存在脱镁叶绿素a 时叶绿素a 的荧光法测定; (5) 高效液相色谱(HPLC) 测定藻类的叶绿素及它们的降解产物; (6) HPLC 测定藻类叶绿素及类胡萝卜素。

藻类的特异性色素是叶绿素、叶黄素和胡萝卜素. 浮游藻类里常见的三种叶绿素是叶绿素a ,b 和c.叶绿素a 在一切浮游藻类里大约占有机物干重的1～2 % ,是估计藻类生物量的好指标. 细胞的叶绿素含量随种类或类群而有所不同,同时还受年龄、生长率、光和营养条件的影响.脱镁叶绿素a (一种叶绿素a 的普通降解产物) 能够干扰叶绿素a 的测定,因为如果存在脱镁叶绿素a ,它能在叶绿素a 的相同光谱区吸收光和荧光,造成叶绿素a 值的误差. 当测定叶绿素a 的时候还要测定脱镁叶绿素a. 叶绿素a 和脱镁叶绿素a 之比可作为浮游植物生理条件的一个良好指标.下文综述了用分光光度法,荧光检测法及高效液相色谱法测定藻类叶绿素及其降解产物的方法：

(1) 叶绿素a , b 和c 的分光光度法测定(三色法) ;

(2) 叶绿素a 的荧光检测法; 

(3) 存在脱镁叶绿素a时,叶绿素a 的分光光度法测定; 

(4) 存在脱镁叶绿素a 时叶绿素a 的荧光法测定; 

(5) 高效液相色谱测定藻类的叶绿素及它们的降解产物; (6) HPLC 测定藻类叶绿素及类胡萝卜素.

1 叶绿素a , b 和c 的分光光度法测定(三色法)

用丙酮水溶液自浮游生物浓缩样萃取色素,用分光光度计测定萃取物的吸光度. 叶绿素自细胞内提出的难度,不同藻类差异相当大. 为了将色素完全萃出,通常需要用组织研磨器机械的破坏细胞.

111 　仪器和试剂

(1) 分光光度计:用窄带的(015～210nm) .

(2) 1cm ,4cm 和10cm 光程的比色池.

(3) 医用离心机.

(4) 组织研磨器(最好使用圆底的研磨管和捣杆) .

(5) 离心管:15ml ,有刻度和螺帽.

(6) 过滤设备:过滤器,滤膜(0145μm 孔径,47mm 直径) 或玻璃纤维过滤器(GFPC 或GFPA ,415cm 直径) ,真空泵.

(7)MgCO3 悬浮液:在100ml 蒸馏水中加入110g 细粉末MgCO3 .

(8) 90 %(体积比) 丙酮水溶液.

112 　测定程序

(1) 离心或过滤浓缩水样. 在离心前或过滤的最后一步加入012ml MgCO3 悬浮液.

(2) 把样品置入组织研磨器,用2～3ml 90 %丙酮水溶液覆盖浸泡.

(3) 把样品移入一个有螺帽的离心管,用几毫升90 %丙酮水溶液洗研磨器,并把洗液加入到萃取液

中,用90 %丙酮水溶液调节体积到5～10ml .

(4) 在盖紧的离心管中于500g 离心20min 澄清萃取液,把澄清的萃取液倾入一支清洁的,标定过的15ml 有螺帽的离心管并测定萃取液的总体积.

(5) 把萃取液移入1cm 的比色池,在750、663、645 和630nm 测定吸光度(OD) .

113 　计算

叶绿素a ,b 和c 的测定分别使用663、645 和630nm 的吸光度. 750 nm 的读数用来校正浑浊度. 将每个色素的OD 值中减去这个浑浊度校正值后,带入下列公式计算浓度:

(1) 叶绿素a (mgPl) = 11164 (OD663 ) – 2116 (OD645 ) + 0110 (OD630 )

叶绿素b (mgPl) = 20197 (OD645 ) – 3194 (OD663 ) – 3166 (OD630 )

叶绿素c (mgPl ) = 54122 (OD630 ) – 14118 (OD645 ) – 5153 (OD663 )

(2) 各单位体积色素量的计算如下:

叶绿素a (mgPm3 ) = 叶绿素a (mgPl ) ×萃取液的总体积(l) / 水样体积(m3 )

2 叶绿素a 的荧光检测法

叶绿素a 的荧光检测法比分光光度法灵敏,需样品较少. 而且不要求像分光光度法那样的波长分辨率,在430nm 的激发波长和在663nm 的发射波长抽取在试管内测定叶绿素a 可过的最佳灵感度.

211 　仪器和试剂

(1) 荧光计,备有高强度F4 T. 5 蓝光灯,光电倍增管R – 136 (红敏) ,可滑动窗孔,光发射(CS – 2 – 64)

和光激发(CS – 5 – 60) 滤光片,以及一个高灵敏度门.

(2) 其他设备和试剂同111

212 　测定程序

(1) 　用已知浓度的叶绿素溶液标定荧光计:

用分光光度法测定浓度约为2、6、20 和60μgPl 的叶绿素a 萃取液,再在每一灵敏度位置对每一溶液进行读数,导出标定系数Fs

Fs = CaPRs

式中　Fs ———灵敏度位置S 的标定系数

Rs ———灵敏度位置S 的荧光计读数

Ca ———分光光度法测定的叶绿素a 浓度(μgPl)

(2) 　在能够取得适中读数的各灵敏度位置测定样品的荧光,将读数乘以适当的标定系数,得到叶绿素a 浓度..

3 　存在脱镁叶绿素a 时叶绿素a 的分光光度法测定

由于脱镁叶绿素在接近叶绿素a 相同的波长上有吸收,因而含有脱镁叶绿素时叶绿素a 的测定值可能偏高. 叶绿素a 由于酸化作用变成脱镁叶绿素a ,吸收峰的值比原来大约降低40 % ,并从663nm 移至665nm ,酸化前后产生的吸收峰之比为1170 ,可用来表观叶绿素a 的浓度作脱镁叶绿素a 的校正.

311 　仪器和试剂

(1) 同111

(2) HCl 1mol·L – 1

312 　测定程序

(1) 用90 %丙酮水溶液萃取色素,离心澄清,在750、663nm 读取OD 值.

(2) 在1cm 的比色池中用两滴1mol·L – 1 HCl 酸化萃取液,轻轻搅拌1～2min 后在750、665nm 读取OD 值.

(3) 酸化前OD663和酸化后OD665值都减去OD750值.

313 　计算

使用校正过的值计算叶绿素a 浓度(C) 与脱镁叶绿素a 浓度(P)

C(mgPm3 ) = 26173 (663b – 665a)V1PV2L

P(mgPm3 ) = 26173[117 (665a) – 663b ]V1PV2L

式中V1 ———萃取液的体积(l)

V2 ———水样的体积(m3 )

L ———比色皿液层厚度(cm)

663b ,665a 分别为酸化前后90 %丙酮水溶液萃取的吸光度.

26173 是吸光度校正

4 存在脱镁叶绿素a 时叶绿素a 的荧光法测定

用荧光法测定脱镁叶绿素a 的浓度,需要测定酸化前后丙酮萃取液的荧光. 叶绿素a 由于酸化后变成脱镁叶绿素a ,致使荧光降低,利用这一原理进行测定萃取液的脱镁叶绿素a 浓度.

411 　仪器和试剂

(1) 同21a

(2) HCl 1mol·L – 1

(3) 纯叶绿素a

412 　测定程序

校准荧光计,在每一灵敏度位置测定酸化前后萃取液的荧光. 计算校准系数(Fs ) ,用酸化前的荧光读数除以酸化后的荧光读数,算出酸化前后的荧光比.

413 　计算

叶绿素a (mgPm3 ) = Fs (Rb – Ra) rP(r – 1)

脱镁叶绿素a (mgPm3 ) = Fs (rRa – Rb) rP(r – 1)

式中　Fs ———灵敏度位置S 的换算系数

Rb ———萃取液酸化前的荧光

Ra ———萃取液酸化后的荧光

r ———RbPRa

5 　高效液相色谱测定藻类的叶绿素及它们的降解产物

511 　仪器和试剂

除色素提取物外还包括:

(1) 高效液相色谱仪,流速为210mlPm.

(2) 装有100 微升进样环管的高压进样阀.

(3) 保护柱(410 3 015cm , C18 , 3μm)

(4) 反相HPLC 柱(C18 , 10cm , 3μm)

(5) 荧光检测器,波长为430 ±30nm ,可发射超过600nm 荧光.

(6) 数据纪录装置,长条纸记录器或电子积分仪.

(7) 注射器,玻璃,250μL

(8) HPLC 洗脱剂:洗脱剂A(80∶15∶5 ;甲醇∶Ⅰ型试剂∶离子对溶液) ,洗脱剂B(80∶20 ;甲醇∶丙酮) .

(9) 校准标准物:分别将1ml 纯叶绿素a 和b 溶于100ml 90 %丙酮中,用分光光度法测定其准确浓度. 用上述叶绿素a 和b 标准物经盐酸酸化后制得脱镁叶绿素a + a′和b + b′标准物;从硅藻中萃取叶绿素c 和脱植基叶绿素a ,酸化脱植基叶绿素a 制得脱镁叶绿素酸a ,分别用薄层色谱法(TLC) 纯化,分光光度法校准,作为标准物.

512 　测定程序

(1) 用洗脱剂A ,流速为210mlPm ,建立和平衡HPLC 系统;校准荧光计的感光度,用叶绿素a 标样的浓度最大值作为满刻度.

(2) 通过先前制备的标准物校准HPLC 系统的工作标准. 分别混合叶绿素与脱植基叶绿素a ,脱镁叶绿素a 和脱镁叶绿素酸a ,作为混合标准物. 混合1ml 标准液与300μL 离子对溶液,平衡5 分钟后进样. 混合1ml 90 %丙酮与300μL 离子对溶液作为空白液. 用150μL 标准液漂洗注射器2 次,注射器中吸入250μL 标准液用于进样,将注射器插入进样阀,充满100μL 的进样环管. 建立标准色素浓度与荧光峰面积(或高) 的标准曲线.

(3) 混合1ml 90 %丙酮色素提取物与300μL 离子对溶液,作为进样样品.

(4) 使用两步溶剂程序,用于优化叶绿素及其降解产物的分离. 进样后,5 分钟内将洗脱剂A 转变为洗脱剂B ,维持B15 分钟,流速为210mlPm. 在下一次进样前,需用洗脱剂A 重新平衡色谱柱5 分钟. 总分析时间约为25 分钟.

(5) 用下列公式计算各色素的浓度

Ci = AsFiVe

PVEVs

式中　Ci = 各色素的浓度mgPl

As = 各次进样的色素峰面积

Fi = 标准响应因子

Ve = 进样体积(011ml)

VE = 萃取体积(ml)

Vs = 样品体积(l)

(6) 这种方法仅用于叶绿素及其降解产物的定量.

(7) 检测限随荧光计结构与流速而变,但对于大多数叶绿素与它们的降解产物来说,每次进样检测限范围在10～100pg. HPLC 法的精确度主要取决于色素标准样的纯度. 更理想的方法是测定标准样的吸收光谱(350～750nm) 并与文献数据相比较. 色素的纯度也可用HPLC 法来测定,条件是不存在能与标准物的吸收和荧光谱带相重叠的共洗脱污染物. 如果分光光度法测得的数据经脱镁色素校正,HPLC 的结

果表达为色素当量(例如:叶绿素a 当量= 脱植基叶绿素a + 叶绿素a + 叶绿素a′,假定使用正确的分子量校正值) ,那么HPLC 法与分光光度法提供的色素浓度与提供的EPA 标准符合得很好. 因此如果明显的存在色素衍生物,用分光光度法测得的数据会偏高. 要HPLC 法与荧光法测得的数据一致则取决于附加的叶绿素b ,c 和它们的衍生物.

6 　HPLC 测定藻类叶绿素及类胡萝卜素

611 　仪器和试剂

除色素提取物外还包括:

(1) 高效液相色谱泵,可进行三种不同溶剂的梯度输出,流速为110mlPm.

(2) 装有200 微升进样环管的高压进样阀.

(3) 保护柱. (50 3 416mm ,C18 ,5μm)

(4) 封尾的反相色谱柱(250 3 416mm ,5μm ,C18 ) .

(5) 可变波长或过滤吸光度检测器,带有低体积流通池,检测波长为436nm.

(6) 数据纪录装置.

(7) 注射器,玻璃,500μL

(8) HPLC 洗脱剂:洗脱剂A(80∶20 ; 甲醇∶015M乙酸铵,pH 712) ,洗脱剂B(90∶10 ;乙腈∶水) ,洗脱剂C(乙酸乙酯) .

(9) 校准标准物:叶绿素a 和b ,β,β2胡萝卜素可购买. 其他色素标准物可用TLC 或制备级HPLC 从植物提取物种纯化得到. 在校准HPLC 系统前,在专用溶剂中使用装有单色器的分光光度计测定所有标准物的浓度. 使用公式:

Ci = 1000 (Aλmax- A750nm)PE1cmb

式中　Ci = 各色素的浓度mgPl

A = 特定波长下的吸光度

E = 吸光系数lPgcm

b = 比色池长度cm

612 　测定程序

(1) 用洗脱剂A ,流速为110 mlPm ,建立和平衡HPLC 系统;

(2) 通过先前制备的标准物校准HPLC 系统的工作标准. 混合1ml 标准物与300μL 蒸馏水,摇动,平衡5 分钟后进样. 用300μL 标准液漂洗注射器2 次,注射器中吸入500μL 标准液用于进样,将注射器插入进样阀,充满200μL 的进样环管. 混合1ml 90 %丙酮与300μL 蒸馏水作为空白液. 建立标准色素浓度与荧光峰面积(或高) 的标准曲线.

(3) 混合1ml90 %丙酮色素提取物与300μL 蒸馏水,作为进样样品.

(4) 样品进样采用梯度程序用以优化叶绿素及类胡萝卜素的分离.

(5) 通过比较样品峰与纯标准物峰的保留时间来定性.

(6) 浓度的计算方法同512. (5)

(7) 这种方法为叶绿素与类胡萝卜素的分离而设计,同时也可以分离主要的叶绿素分解产物. 方法的精确度由测定三倍进样的浮游植物群落和植物的提取物确定. 使用合适的内标物可提高精确度.