Microcystin Plate Kit
一、基本原理
酶联免疫(ELISA)是免疫酶技术的一种，是将抗原抗体反应的特异性与酶反应的敏感性相结合而建立的一种新技术 ELISA 的技术原理是:将酶分子与抗体(或抗原)结合，形成稳定的酶标抗体(或抗原)结合物，当酶标抗体(或抗原)与固相载体上的相应抗原(或抗体)结合时，即可在底物溶液参与下，产生肉眼可见的颜色反应，颜色的深浅与抗原或抗体的量成比例关系，使用ELISA检测仪，即酶标仪，测定其吸收值可做出定量分析。此技术具有特异、敏感、结果判断客观、简便和安全等优点，日益受到重视，不仅在微生物学中应用广，而且也被其他学科领域广为采用。本试剂盒工作原理如下图所示。
二、已配试剂
ELISA 试剂盒中配备以下条目:
1、96 孔已包被好的酶标板
2、标准 1:0.1 ng/mL 的 MC-LR 标准溶液
3、标准 2:0.2 ng/mL 的 MC-LR 标准溶液
4、标准 3:0.5 ng/mL 的 MC-LR 标准溶液
5、标准 4:1ng/mL 的 MC-LR 标准溶液
6、标准 5:2ng/mL 的 MC-LR 标准溶液
7、1瓶溶液1(单抗)
8、1只溶液2(此溶液仅为二抗稀释所用，并非二抗溶液，请按稀释比例量取!)
9、二抗(小管内含 2.4 μL酶标二抗，4℃保存)。
10、1瓶溶液3(底物溶液)
11、1瓶溶液4(终止液)
12、1袋固体PBS(配置洗涤液用)
13、1只Tween20(配置洗涤液用)
三、需配器材及试剂
除试剂盒内的物品外，还需配备以下器材和试剂:
1、酶标仪(若可能，可配有洗板机)
2、微量移液器(100mL)(若可能，可配8道或12道微量移液器)
3、吸管、橡皮吸头(洗板时用，若有洗板机，无需准备此项)
4、纯水(用于配置洗涤液)
5、玻璃瓶(盛装洗涤液)
6、记时器(准确控制每步操作时间)
7、封口膜(防止孔内液体挥发)
四、酶标二抗的配置
将小管二抗用溶液2按1:5000稀释，充分溶解混匀，现用现配
五、洗涤液的配置
将固体PBS以纯水配置成1L溶液(pH7.4-7.6)，从塑料小管取出0.5 mI
Tween 20 于前配置的PBS溶液中。室温保存。
六、样品的预处理
1、藻样的处理:采集的藻样可以三种方法处理:a.冻融(2-3次);b.超声破碎
c.细胞压榨机破碎。
2、水样的处理:将采集的水样离心取上清或过滤。
3、水产品的处理:方法较复杂，可参考文献方法:Valéria Freitas de Magalhǎes,
Raquel Moraes Soares, Sandra M.F.O.Azevedo. Toxicon, 2001,39:1077
七、操作步骤
1、分别吸取50μL毒素标准品或样品与对应的孔中(参照表 1),然后吸取50μL
单克隆抗体(溶液1)加入每孔中，轻轻混匀。37°℃或室温放置90分钟。
注意:必须先加标准品或样品，再加单克隆抗体溶液。
2、洗板
在水池边快速甩出酶标板中的液体。用吸管吸取洗涤液，加入板孔中，洗涤液量以加满但不溢出板孔为宜。甩出洗涤液，再加洗涤液，重复上述操作三次，每次操作3分钟。在滤纸上拍干。若有洗板机，可直接在洗板机上操作。
注意:切忌溢出互混!
3、每孔加入100mL酶标二抗稀释液，37℃或室温放置30分钟。
4、洗板
同2方法，此步骤必须洗涤五次，每次3分钟。
5、加底物溶液 3
立即用排枪或吸管吸取此种溶液，分别加于板孔中，每孔100μL，置37℃或室温显色，经常观察，显色时间不超过30分钟。
6、终止反应
有明显颜色显示后，立即加50μL溶液4 1mol/L H2SO4终止反应。
7、判断结果
肉眼观察(白色背景)，阴性对照孔应明显黄色。
测光密度，酶标仪取λ=450nm。注意:加终止液后，30分钟以内检测。
注意:滴加试剂量要准，且试剂不可从一孔流到另一孔中，每种试剂对应一种吸管(或枪头)，不能混淆。
八、数据处理
1、酶标板中对应孔加样情况:
C1、C2、C3、C4、C5:毒素标准; S1~S42:被检测样品
2.计算每个标准或样品的平均OD450值，并按以下公式算出B0.
3.根据标准样品的B0值与对应浓度对数值之间的关系做出标准曲线,下图标准曲
线可以作为参考。
4.根据标准曲线计算每个样品的浓度。
本试剂盒的研制获得国家高技术研究发展计划(863计划)“蓝藻毒素分析技术体系及现场快速测试技术”(编号:2001AA641030)、“蓝藻毒素现场快速测试技术与产业化”(编号:2003AA641020)等项目的支持。
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