光合细菌(红螺菌)培养基

1、富集培养基: 

经典的紫色非硫细菌(红螺菌)的富集培养基的配方为:NH4Cl:0.1g; NaHCO3:0.1gK2HPO4:0.02gCH3COONa0.1~0.5gMgSO4·7H2O0.02g; NaCl0.050.2g 生长因子1ml,蒸馏水97ml,微量元素溶液1ml,pH为7.0。

其中,①5%NaHCO3水溶液,过滤除菌取2m1加入无菌培养基中。②生长因子:维生素B10.001mg、乙尼克丁酸0.1mg、对氨基苯甲酸0.1mg、生物素0.001mg,以上药品溶于蒸馏水中,定容至10ml,然后过滤除菌。③微量元素溶液:FeCl3·6H2O :5mg;CuS04·5H2O:0.05mg;H3BO4lmg;MnCl2·4H2O:0.05mg;ZnSO4·7H2O:1mg;Co(NO3)2·6H2O: 0.5mg。以上药品分别溶于蒸馏水中,并定容至1000m1。

除①、②、③外,各成分溶解后100 Pa灭菌20min。然后分别加入①、②、③,如加入0.1%~0.3%的蛋白胨则能促进该菌生长。

2、分离培养基:

传统的红螺科分离培养基的配方为:NH4Cl:0.1g; MgCl2:0.02g; 酵母膏:0.01g; K2HPO4:0.05g; NaCl: 0.2g; 琼脂2g,蒸馏水90ml。100Pa灭菌20min。

灭菌后,无菌操作加入经过滤除菌的0.5g/5mlNaHCO3,再无菌加入过滤除菌的0.1g或0.1mlNa2S·9H2O(降低培养基的氧化还原值),最后再加入5ml经过滤除菌的乙醇、戊醇或4%丙氨酸。用过滤灭菌的0.1mol/H3PO3调pH至7.0。

 

 

3、筛选富集培养基

           NH4Cl 1g/L, NaHCO3 1g/L, CH3COONa 3g/L, KH2PO4 0.3g/L, MgSO4 0.1g/L, 酵母膏0.5g/L, 微量元素母液1g, 自然pH值。扩大培养培养基以海水代替微量元素母液。1000~4000lx光照, (30±2)℃恒温培养。

参考文献:固定化海洋光合细菌处理生活污水的研究*   黄宝兴,李兰生,赵亮,张微,唐迎迎    海洋湖沼通报

 

4、基础培养基

NH4Cl:1g; Na2HPO4: 0.5g; MgSO4: 0.2g; NaCl: 2g; NaHCO3: 5g; 酵母膏:2g ; 乙醇2ml,用 0.1N H3PO4调至pH7.0

划线培养基:采用固体琼脂培养基,即在基础培养基的基础上添加1.0%的琼脂。

以上培养基初始pH值均用H3PO4调至7.0,经121℃灭菌30分钟,NaHCO3过滤除

菌后加入。培养条件:光照培养箱温度控制在30℃、光照强度控制在 3000uE.m-2s-1培养。

光合细菌是一种兼性嫌气细菌,需要深层培养或在真空干燥器内达到嫌气或半嫌气状态,一般将混合菌放入培养液中先富集再分离。具体方法:将混合菌装入 10ml试管中,加入培养液充满至刻度,盖上胶塞,在光照条件下保持在30℃左右培养。待培养液出现红色后,取培养液加1.5%的琼脂,制成固体培养基,取菌液分别用无菌水以10-100000000倍稀释,分别取lml样本涂在平皿上,光照、30℃培养2d左右在平板上长出菌落。移至平板采用划线法进行分离,将划好线的平板倒置,在相同条件下培养,反复分离纯化,挑取不同特征的菌落,用斜面保存,纯化分离后的菌种置于冰箱保存备用。

 

PSB 培养中除碳、氮、磷等主要营养元素外,还需要一定量的镁、钙、钠和有关的微量元素,将所需的营养元素按一定的比例配成适于菌体生长繁殖的培养基。本实验室采用酵母膏、蛋白胨培养基,基本配方为:CaCl2 0.3gMgSO4·7H2O 0.5g,酵母膏3g,蛋白胨3g,蒸馏水1000mlpH: 6.8. 如需制固体培养基再加2%琼脂。培养温度:25℃~30℃最佳,光照强度:2000LX5000LXPH7.58.5最佳。

 

把菌种接种到灭好菌的培养基中,在三角瓶中进行二级培养,每天摇晃几次。把 40L 的反应器中加满自来水,放入通气管,盖上保鲜膜一起用次氯酸杀菌消毒24小时,用硫代硫酸钠(1L次氯酸需要150g硫代硫酸钠)来中和。以15%的接种量接入反应器中,用泵通气培养,用分光光度计跟踪测量菌液的密度,得到菌液的密度较高,而且反应器还可以进一步放大。

5、细菌生长培养基

NaCOOH3.0g.酵母膏3.0g,NH4CL2.0g,KH2PO4 0.5g,天然海水1000ml,高温灭菌。

100ml具塞容量瓶中装有50ml光合细菌培养基,按10%接种量接种母液(约每毫升10亿个细胞)混合均匀后置于恒温光照培养箱中光照厌氧培养,光强2500Lux,温度30摄氏度。

6、HCH光合细菌培养基

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灭菌条件

1)高压蒸汽灭菌 小件玻璃器皿、培养基等采用湿式高压蒸汽灭菌。这种灭菌方式可以达到彻底的灭菌。灭菌条件:0.103 MPa120 ℃,20min

2)紫外灭菌 无菌操作台采用紫外灭菌方式,用紫外灯灭菌 30min。该种方式对空气进行灭菌。

光合细菌的纯培养

本课题研究所用光合细菌为 Z08,除特殊说明外,皆是由纯培养获得。将 50 mL HCH 培养基灌装于 250 mL 三角瓶,用封口膜将瓶口密封,以防止灰尘和杂菌进入。灌装好的培养基采用高压蒸汽灭菌 20 min。待冷却以后,在无菌操作台中接种 OD660=1.0(干重 840 mg/L)的 Z08 15 mL。接种后将菌液放置在 140 rpm 的恒温摇床中培养,控制温度 30 ℃,24 h 照明,照度 5001000 lx,培养 48 h 达到稳定期。培养后的光合细菌保存在 4℃条件下备用。

红色非硫光合细菌富集培养基的配制NaHCO3 1.0 g; NH4Cl 1 g; K2HPO4  0.2 g;CH3COONa 1.0~5.0 g;MgSO4·7H2O 0.2 g; NaCl 0.5~2.0 g;酵母浸汁0.1 g;微量元素10 mL

将上述成分溶于蒸馏水中,调节pH7.0,定容1000 mL。在115℃下灭菌20 min

光合细菌的分离与培养

① 液体富集培养基:CH3COONa 3.0 g CH3CH2COONa 0.3 gNaCl 1.0 g(NH4)2SO4 0.3 gMgSO4·7H2O 0.5 gK2HPO4 0.7 gCaCl2 0.05 gMnSO4 0.0025 gFeSO4 0.005 g,酵母膏 0.1 g,谷氨酸 1.0 g,蒸馏水定容至 1 L,调 pH 至 7.4

② 固体分离培养基:CH3COONa 3.0 g·L-1,酵母膏 3.0 g·L-1,CaCl2 0.3 g·L-1,MgSO4·7H2O 0.5g·L-1,琼脂 20 g·L-1,调 pH7.4

培养条件:取少量活性污泥样品于装有 120 mL 富集培养基的 125 mL 血清瓶中富集,置于光照培养箱中 30 ℃培养,照度为 2000 1x6~9 d 后,液体培养基变为红色,经摇床振荡稀释处理后,涂布和划线于平板固体培养基上,置于恒温培养箱中黑暗好氧培养,7 d 后获得单菌落。在平板固体培养基中重复划线 次以上,直到在显微镜下观察为纯菌。

 

7、RCVBN扩大培养基

优化培养实验采用RCVBN扩大培养基,其组成为:CH3COONa 3.0g, (NH4)2SO4 1.0g, MgSO4 0.2g, NaCl 1.0g, KH2PO4 0.3g, K2HPO4 0.5g, CaCl2 0.05g, 酵母膏0.1g, 微量元素溶液1mL, 蒸馏水1000mL.

微量元素溶液为改良的ImhoffTruper生长因子溶液,其组成为: EDTA-2Na 2g, FeSO7H2O 0.2g, MnCl2·4H2O 0.1g, H3BO3 0.1g, CoCl2·6H2O 0.1g, ZnCl2 0.1g, Na2MoO4·2H2O 0.02g, NiCl2·6H2O 0.02mg, CuCl2·2H2O 0.01g, 蒸馏水1000mL

培养方法

8CSTR光合培养器中进行分批培养,培养器体积为50 L。培养器光照根据强度不同的需要分别由三只25W,40W,60W,100W白炽灯泡组合提供,培养器的底部设有穿孔曝气管,根据DO含量间歇开启,培养器内设有温控器。

8、光合细菌参考培养基

无水乙酸钠5mg,氯化铵1.0mg,磷酸氢二钾0.2mg,MgSO4·7H2O 0.2mg, 碳酸氢钠1.0mg,酵母浸膏0.1mg,氯化钠1.0mg调节pH为7.1-7.2, 1.05Mpa,121摄氏度灭菌20分钟,固体培养基为液体培养基基础上添加15-20%琼脂

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