微藻保存技术

微藻营养丰富,是鱼、虾、贝等经济动物人工育苗的基础。特别是海洋微藻,由于富含EPA和DHA,在许多方面受到人们的青睐。在微藻的培养和应用中,保种技术十分重要,它是微藻培养和进一步应用的基础和关键环节。由于藻种极易受污染,分离培养方法比较复杂而且耗时较长,因此,在微藻保种工作中要尽量减少接种次数,避免藻种被杂藻、细菌或原生动物污染,既能达到长期贮藏种质的目的,又能维持藻种的活性,是微藻科研工作者努力的方向之一。本文就微藻保存的几种常用方法介绍如下。

一、继代法保存

继代保存法是目前普遍采用的方法,使用于一切藻种的保存。通常在常温或常低温进行。常温一般指15℃~25℃,常低温一般指0℃~15℃,藻种可接种在固体、液体或双相培养基中。接种后应首先放在适宜的光照条件下培养,待藻细胞生长繁殖达到较高密度,可见明显的条状或块状的藻细胞群时,再移置低温、弱光的条件下保藏。保藏半年到1年后必须进行转接。此方法简单易行,但是保存时间短,而且继代频繁,容易发生污染和变异。

二、固定化保存法

固定化细胞(1mmobilized cells)是指将游离细胞包埋在多糖或多聚化合物制成的网状支持物中,固定载体束缚藻种,影响其代谢过程,从而抑制细胞的生长和分裂。固定化微生物技术是在20世纪60年代固定化酶技术的基础上发展起来的,1978年以来,固定化技术就被用来作为延长光合细胞寿命的一种重要手段。但微藻存活时间从1个月到几年不等。张继红将三角褐脂藻固定在褐藻酸钙凝胶中,可保存3~5年;Tamponnet等报道了固定化纤细裸藻存活2年;矮小海链藻(Thalassiosira pseudonana)和贺氏钙板金藻 (Emiliana hux liyi)仅能保存3个月。近来孟妍等人采用褐藻胶包埋技术与干燥脱水技术相结合将绿色巴夫藻常温保存,保存时间可达6个月存活率高达77.6%。

固定化保种技术对多数微藻是适用的,该法可以在常低温下实现对藻类的中期保存,培养保存时间较长,活化复苏快,技术设备简单,细胞外渗少,而且可用于次生代谢物质的生产。在一般的微藻实验室内都能进行。但固定化程序较复杂,大多数微藻在培养后期常会从胶珠中溢出。而且,现有的资料表明,某种固定化方法只适用一定种类的微藻,对于其他种类的微藻会有不同的反应,原因复杂,还需要做更深入、广泛的研究。这就给固定化保种技术的推广带来了一定的困难。

三、超低温保种技术

所谓超低温保存区别于其他低温概念的冰箱温度(4℃~~40℃)和干冰温度(~79℃),是指在液氮低温(~196℃)下保存。此时生物体的物质代谢和生长活动几乎完全停止。可是它们仍处于可逆的成活状态。早在20世纪70年代,英国的Morris等就对海产单胞藻进行了超低温保存研究,取得了在~196℃下保存1年,存活率100%的结果。目前普遍采用两步冷冻法,即慢速降温进行冷适应,然后投入液氮中保存。王起华等用两步冷冻法研究了3种饵料金藻,其存活率均在30%左右。

超低温保存法具有保持种质遗传稳定性、对藻种进行优胜劣汰、便于长期保存、能最大限度地减少污染等方面的优点,还能省去藻种的活力监测和繁殖更新。但微藻的种类很多,生理状态各异,适宜的保存条件各不相同,找出不同微藻的超低温保种方法困难,而且不同的细胞要求不同类型、不同浓度的抗冻剂, 至今还没有找出1种对所有种类都适用的保护剂。但随着研究的深入,在探明生物细胞冻害和抗冻机理的基础上,超低温保存微藻藻种的应用前景将会是十分光明的。

四、浓缩低温保存技术

浓缩低温保存法是将藻液高密度培养后,采用物理、化学的方法浓缩1000倍左右,再低温保存。国外自80年代末开始就有对海洋经济微藻的浓缩方法和低温保存方法进行研究,取得了不少的研究成果,其中美国、英国和日本已有相应的产品(微藻浓缩细胞或称“藻膏”)问世。蒋霞敏等将小球藻和球等鞭金藻301(1sochrysis galbana Park)浓缩后,在5℃~7℃的冰箱中保存1~3个月后恢复生长获得好于常温的效果。孙建华、王如才(1993)对小新月菱形藻(Nitzschia closterium)、球等鞭金藻的浓缩和保存方法进行了研究,浓缩藻液在1℃~4℃的低温下加保护剂SAMs保存3个月,复苏后效果良好。
浓缩低温保存多用于海洋微藻。微藻浓缩液的生产,可以使海洋微藻的生产与使用保留一定的时间差。但相对保存时间较短,海洋微藻的抗逆原理还有待作更多的研究和探讨。

五、冷冻真空干燥保存法

冷冻真空干燥保存法是在极低温度下(~70℃左右)快速冷冻,然后在极低温度下真空干燥,使藻种的新陈代谢活动处于高度静止状态。19世纪末Fkral与Mudd创立的冷冻真空干燥法是迄今公认最佳的藻种保存法,严珍等选择脱脂牛奶作为保护剂,将藻液放入安瓿管中,冷冻、干燥并抽真空,火焰熔封。在低温避光处保存,预计最大保存年限为18年。冷冻干燥保存法优点是微藻复苏效果好,保藏期内可避免其他杂菌污染,便于携带运输,易实现商品化生产;其缺点是操作繁琐、对设备要求高等;应用前景十分光明。

六、低温甘油生理盐水法

低温甘油生理盐水法是对甘油原液保存法的改进。加入生理盐水适当降低了甘油的高渗作用,更有利于藻种的保存。在藻液中人一定的甘油作保护剂,同时加入一定的生理盐水,混匀后直接放置在~20℃±0.5℃冰箱放置保存。保存时间长,一般3年左右。
综上所述,单细胞藻类的保种技术尚没有发展成为一项成熟稳定的技术,许多问题还有待于我们去探索,开展微藻保种方面的研究工作,不但会填补微藻保种理论研究上的空白,还会在生产实践中发挥应有的作用。

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