微囊藻毒素分析试剂盒说明书
（时间分辨荧光免疫法）
【产品名称】
通用名称：微囊藻毒素分析试剂盒（时间分辨荧光免疫法）
【包装规格】
96测试/盒
【预期用途】
本试剂盒适用于水中、藻样或水产品中微囊藻毒素的定量检测。
- 水样的处理：将采集的水样离心取上清或过滤后的滤水直接测定。
- 藻样的处理：采集的藻样可以三种方法处理：a. 反复冻融（3-5次）；b. 超声破碎；c. 细胞压榨机破碎。
- 水产品的处理：方法较复杂，可参考文献方法：Valéria Freitas de Magalhães, Raquel Moraes Soares, Sandra M.F.O. Azevedo. Toxicon, 2001, 39:1077
【检验原理】
时间分辨荧光免疫分析（Time-resolved fluorescence immunoassay，TRFIA）是目前标记免疫学技术中灵敏度和稳定性较高的新一代免疫学检测技术。其利用具有独特荧光特性的镧系元素及其螯合物为示踪物,代替酶、同位素、化学发光物质等来标记抗体或抗原，待抗原或抗体反应发生后，用时间分辨荧光免疫分析检测仪测定反应产物中的荧光强度。本TRFIA试剂盒的技术原理是样品中的微囊藻毒素与微囊藻毒素-BSA铕标记物竞争结合抗微囊藻毒素单克隆抗体。检测过程中，先加入单抗到测试孔中，测试孔中已包被有羊抗鼠lgG，用于捕获加入的鼠抗微囊藻毒素单抗，接着加入含有微囊藻毒素的样品及微囊藻毒素-BSA铕标记物，铕标记物与样品中的微囊藻毒素竞争结合同样的抗体结合点。孵育后洗掉小孔中所有没有结合的分子，加入增强液，铕在增强液作用下从复合物上解离后发出强的荧光。
由于各个孔中抗体可结合位点是相同的，并且加入的微囊藻毒素铕标记物的量也是相同的，样品中微囊藻毒素含量低的则铕标记物结合得多，检测荧光值高。反之，样品中微囊藻毒素含量高的则铕标记物结合得少，检测荧光值低。荧光值与微囊藻毒素的含量成反比。本试剂盒的检测示意图如下：
【主要组成成份】
| 组份名称 | 规格 | 数量 | 主要成分 |
| MCLR标准品 | 0.5 mL/瓶 | 6 | A 0ng/mlL B 0.1ng/mL C 0.3ng/mL D 1.0ng/mL E 2.0ng/mL F 4.0ng/mL |
| MCLR铕标记物 | 0.5 mL/瓶 | 1 | Eu-BSA-MCLR，BSA、Tris-HCl，防腐剂 |
| MCLR反应板 | 96孔/块 | 1 | 鼠二抗，微孔板 |
| MCLR分析缓冲液 | 30 mL/瓶 | 1 | Tris-HCl、NaCl，BSA等 |
| MCLR单抗 | 6 mL/瓶 | 1 | MCLR单抗、NaCl，BSA等 |
| 增强液 | 50 mL/瓶 | 1 | β-NTA、TOPO等 |
| 浓缩洗液25× | 40 mL/瓶 | 1 | Tris-HCl、NaCl、Tween-20等 |
| 封片 | 张 | 3 | / |
| 说明书 | 份 | 1 | / |
| 纯化水 | 10.0 mL/瓶 | 1 | / |
【自备的设备和试剂】
时间分辨荧光免疫分析仪；
100 mL量筒或其他适用容器；
振荡器；
洗板机；
不同量程的移液器；
蒸馏水或去离子水；
其他适用企业校准品。
【储存条件及有效期】
- 本试剂盒于2~8℃储存，有效期12个月。开封后，储存于2~8℃，试剂盒有效期为4周。
- 请将不用的微孔板放进原锡箔袋中，并且与提供的干燥剂一起重新密封。
- 试剂盒生产日期和失效日期见产品标签。
【适用仪器】
1. 广州市达瑞生物技术股份有限公司DR6606或DR6626时间分辨荧光免疫分析仪。
2. 可适用镧系时间分辨荧光免疫分析检测的其他仪器。
【检验方法】
- 试剂的准备
（1）洗涤液：将40 mL浓缩洗液和1000 mL纯化水混合（1:25倍稀释），作为工作洗涤液。
（2）MCLR铕标记物：用分析缓冲液以1:20倍稀释作为铕标记物工作液，一次配制一次试验所需用量。
- 将所需数量的包被反应条置室温平衡。
- 每孔50 μL MCLR标准品或样品，50 μL MCLR铕标物，50 μL MCLR单抗，按顺序加入微孔反应条小孔中，并加贴封片，室温振动孵育45分钟。
- 用洗涤液冲洗6次，拍干。
- 每孔加入增强液150 µL，室温振荡孵育5分钟。
- 测定荧光值，激发光为340nm，发射光为615nm。
【计算方法】
可采用以下两种方法进行标准曲线的绘制，计算样品中的微囊藻毒素浓度：
1、半对数拟合法
测值之后计算标准品平均荧光值，A点即0ng/ml的荧光值为Bmax，计算出标准品B至F点（0.1，0.3，1.0，2.0和4.0ng/mL）的结合率B（B标准品/Bmax），以B（B标准品/Bmax）作为Y轴，微囊藻毒素标准浓度的对数值为X轴（InMC），绘制曲线，获得线性拟合方程。通过每个样品的结合率（B样品/Bmax），根据拟合方程计算出样品中的微囊藻毒素浓度。
2、logit-log拟合法
Logit-log是免疫学检测中的用于竞争法的经典模型。与半对数拟合法类似，测值之后计算标准品平均荧光值，A点即0ng/ml的荧光值为Bmax，并计算出标准品B至F点（0.1，0.3，1.0，2.0和4.0ng/mL）的结合率B（B标准品/Bmax），纵坐标为，微囊藻毒素标准浓度的对数值为X轴（InMC）, 绘制标准曲线,获得线性拟合方程。通过每个样品的结合率B（B样品/Bmax），根据拟合方程计算出样品中的微囊藻毒素浓度。
在用上述两种方法计算样品中的微囊藻毒素浓度时，如果样品结合率B（B标准品/Bmax）在设定的标准结合率范围之内，就可以得出一个具体的浓度值。如果样品结合率超出了范围则说明样品的浓度大于高浓度的标准（本试剂盒中为4ng/ml）或低于低浓度的标准（本试剂盒中为0.1ng/ml），高浓度样品需稀释后重测，低浓度样品则需富集后重测。
【产品性能指标】
- 剂量反应标准曲线的线性相关系数r2值应 ≥ 0.99；
- 精密性：本试剂盒检测的变异系数（CV）应 ≤ 15.0%。
【注意事项】
1. 请严格按照说明书操作。
2. 不同批号的试剂盒不要混用；本试剂盒各组分只能一次性使用，不能重复使用。
3. 整个实验过程应尽量在干净无尘的环境下进行。
4. 本试剂盒与待检样本使用前必须平衡至室温。
5. 为了避免样本中任何潜在的生物危险，检测样本应视为具有传染性物质，避免接触到皮肤和粘膜。
6. 洗板机在每天使用时应进行校正注液量和残留量，注意管道是否通畅。洗涤时，确认每孔中的洗涤液都注满微孔。每次洗涤后都需在无尘吸水纸上拍干微孔中的液滴。
7. 使用干净的一次性容器配制铕标记物，应避免铕标记稀释液进入铕标记物原液中。
8. 加增强液时，吸头应悬空，避免因吸头碰到小孔边缘或其中试剂而造成增强液污染。
9. 本试剂盒中所有试剂应置于2~8℃冰箱保存，自生产日期起有效期为一年。开启后请尽量避免反复使用，板条若未能一次用完，剩余板条用塑料袋封口后密封保存。