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单细胞藻种质分离、培养和应用

第一章 藻种的分离技术 第一节 采样方法 水样可以取自任何有可能生长所需单胞藻的水体,通常在海岸边退潮后留下的小水洼中或者在养殖场、盐场等地方的小水坑中,生长有适合静水培养的单胞藻类,而且比较纯。在实验场、育苗场的一些水池、水桶中都有可能出现比较纯的藻类。采样时要同时测定水样的温度和盐度,供分离、培养时参考。 水样采回后,进行现微镜检查,如果需要分离的藻类比较多,可以立即进行分离。如果在水样中有需要的藻类,但是数量不多,就要进行预培养,待其繁殖起来后再分离。预培养可以用500ml的三角烧瓶,加入150ml的培养液,然后把经350目筛绢过滤的水样150ml接种进去,在一定的温度和光照下静止培养,每天摇动1~2次。用作预培养的培养液,可选择各类藻类通用的培养液配方或者同时采用几种不同藻类的培养液同时分别培养。预培养的培养液的浓度应小些,一般只用原配方的1/2或1/4。如果要分离的藻类的最适生长条件是已知的,那就在其最适的光照和温度下培养。如果不知其最适生长条件,那就在人为设定的条件下培养,以便适应应用时的特定环境。 第二节 分离方法 一、微吸管分离法 用直径0.5厘米、长35厘米的普通玻璃管,在中央部分加热,拉长6~10厘米,使玻璃管的直径缩小至0.06~0.1厘米,把它折断后即成二个吸管。把一团棉絮塞进吸管的宽大一端,然后放入高压灭菌器中消毒。消毒后,再在酒精灯上加热吸管的细端,用镊子拉成极细的微管,直径缩小至0.08~0.16毫米即可。微吸管在入水的瞬间,因毛细管的作用会吸入微量的水。将藻液水样放在凹玻片上,在显微镜下用微吸管仔细地吸出单个藻体,滴在载玻片上,在显微镜下确认是所要分离的单个藻体后,移入经灭菌的培养液中培养。 二、平板分离法 按所要分离的藻类的特性,选用合适的培养液,在培养液中加入1~1.5%的琼脂,加热将琼脂溶化。加热后要加淡水补充蒸发掉的水分。然后,按照微生物学中固体培养基的制作方法倒平板、灭菌。 在无菌操作箱中,用接种针蘸取少量藻液,在固体培养基上划蛇形线,藻细胞就会散布在琼脂培养基的表面。 另一种使藻细胞散布在培养基表面的方法是用医用口腔喷雾器,将经稀释的藻液喷在培养基的表面。 将接种好的培养皿放在有适合的光照和温度的地方培养。一般经过十来天的培养就会在培养基上长出相互间隔的藻落。通过显微镜检查,找出所要的纯的藻落,再用已消毒的接种针从培养基上挑取藻体,移入经灭菌的培养液中培养。 三、水滴分离法 先将欲分离的藻液稀释,用微吸管将少量藻液吸出,滴在载玻片上,每张载玻片上可以滴数滴。水滴大小以在低倍显微镜下一个视野能包括整个水滴为准。在显微镜下逐个观察水样,挑选水滴中只有所要分离的单个藻体,而没有其他任何杂藻或小动物的,移入经灭菌的培养液中培养。 四、稀释分离法 用已消毒的试管5支,在第一支试管中加蒸馏水10毫升,第二和第五支试管都加5毫升,用高压蒸汽消毒,待冷却后,在第一支试管中滴入混合藻液1滴,充分震荡,使其均匀稀释。再用经消毒的吸管从第一支吸管中吸取5毫升到第二支吸管中,充分震荡后再取5毫升到第三支试管中,如此直至第五个试管。再取5个已装有消毒的培养基的培养皿,加热使培养基熔化,待冷却而尚未凝固时,分别滴入5个试管中的藻液各1滴,用力震荡,使藻液充分混入培养基中。等冷凝后将培养皿放在适合的条件下,直到培养基中出现藻落。在稀释适当的培养皿内,藻落和细菌群落会充分分离。再在无菌条件下将选取单个藻落接种到固体培养基的表面,再培养。重复数次,直至得到纯的藻落。 第二章 藻种的保存技术 保存藻种时可以根据保种目的和保种条件的不同分别采取不同的保种方法。 第一节 固体培养基保存法 此法通常把藻种接种在固体培养基上,在弱光低温条件下保存,接种一次可以保存半年到一年。 保种用的固体培养基的营养浓度应比正常的液体培养液的高,一般增加一倍。琼脂量为1~1.5%。保种用的培养容器可用三角烧瓶、试管和克氏扁瓶。固体培养基分装灭菌后,冷却待用。 将无污染的藻种用喷雾法或划线法接种到固体培养基上,在弱光条件下,让细胞在培养基上慢慢地生长繁殖,可保存半年到一年。 可进行低温保存的藻种,最好在低温环境中保存。接种后,首先放在光线充足的地方(防止直射光照射),使藻类细胞较快速地繁殖起来,直到培养基上出现颜色,即可放入冰箱或冷库中,一般在5℃左右的低温下保存。当然,不同的藻种保存的温度也不尽相同。每天应给藻种几个小时的弱光照。此法保存的时间可长达2至3年。如新月菱形藻可保存34个月,三角褐指藻可保存25个月,角毛藻和骨条藻可保存9个月。 第二节循环移养保存法 此法采用的容器一般为三角烧瓶(300毫升、500毫升、1000毫升等)和细口瓶(10000毫升、20000毫升等),将容器、工具消毒后,加入正常浓度的培养液,接种后瓶口用消毒的滤纸包扎,放在适宜的温度和光照条件下培养。白天摇动瓶子数次。一般5~10天即可移样一次。此法简单、容易掌握,而且保存的藻种活力强、纯度高、数量大。 资源来自:中国科学院海洋研究所海洋生物种质库…

单胞藻培养技术要点

一、慎重处理单胞藻培养用水 作为生产性藻种培养用水,必须要经过煮沸灭菌,冷却至室温后再使用,在冷却过程中必须加盖,无盖的容器可用清洁的白纸盖在瓶口。而二、三级藻类的培养用水可用化学方法来消毒,即在已经清洗过的池子中,放入经过沙滤或用脱脂棉过滤处理后的海水,再在池内海水中放入若干量的漂白粉,使池内海水中有效氯的含量为20~30毫克/升,充分搅拌均匀后经过8~10个小时的消毒,再进行强充气,一般曝气10小时左右,再加入等当量的硫代硫酸钠,来中和水体中可能残留的有效氯,并经测定水体中无残余有效氯后即可使用。 经过处理后的海水最好能在短时间内用完,尽量不要超过一天,以防止再次被污染。 二、容量和工具的消毒 作为藻种级培养用的三角烧瓶等容器,必须用加热法或煮沸消毒法杀菌。作为生产性扩大培养用的玻璃瓶、水泥池等,通常用300~400毫克/升的高锰酸钾溶液或者含有效氯200~300毫克/升的漂白粉水溶液来浸泡消毒,具体的做法是:先用淡水或普通海水把容器或藻类池冲洗干净,再把容器或工具放入已配制好的高锰酸钾溶液(或漂白粉溶液)中浸泡5~10分钟,取出后用消毒过的海水冲洗干净即可使用。对藻类池的消毒,可用配制好的高锰酸钾溶液(或漂白粉溶液)由池壁顶部淋洒下来,并泼洒池底,过10分钟左右用消毒过的海水冲洗干净即可使用。 三、加大各级培养中的接种比例 一般藻种级培养接入的藻种与新培养液的比例为1∶0.5~1,中间培养或大面积培养,它们的比例为1∶3~6,这样藻液中可繁殖的单胞藻个数多,培养液中藻类增长速度快,缩短了培养时间,相对减少了污染。另一方面也利用了生物间的拮抗作用,增大了培养液中藻种的浓度,来抑制其他杂藻及敌害生物的繁殖,减少藻液被污染的可能性。 四、接种时间 接种时间一般选择在上午8:00~10:00之间进行,不宜在晚上接种,因为晚上不少藻类沉在底部,而白天藻类进行光合作用,趋光上浮,便于观察其运动能力,还可起到选种的作用。 五、日常管理中应注意搅拌 搅拌可促进藻类的生长繁殖,其作用主要是: 第一,通过搅拌增加水和空气的接触面,以补充由于藻类光合作用对二氧化碳的消耗; 第二,帮助沉淀的藻类细胞上浮而获得光照; 第三,防止水表面产生菌膜。搅拌要定时进行,且时常更换方向,以免造成漩涡式水流。同时搅拌不要太猛,防止藻液溅出。 光照调节光照适合与否,对培养藻类的生长关系很大,目前生产单位都是利用自然光培养,但易变,所以,在培养管理中,必须根据天气情况,调节光照强弱,力求光照强度尽可能适合于培养藻类的要求。晴天藻类室用白色的确良布作布帘遮光,防止直射强光照射;雨天光照最差,要把培养瓶尽量靠近窗口,有条件的可利用人工光源照射。 温度调节每一种藻类都有其适应温度范围和最适温度范围,但目前绝大多数单胞藻的培养还不具备控温条件,只能顺从自然温度的变化,在不同季节选择能适应或基本适应当地温度变化条件的培养种。 一般高温对藻类生长不利,在夏天进行室内培养须把门窗打开通风降温。   六、敌害防治 在单胞藻的培养中,敌害生物的污染和危害是造成藻类培养失败的主要原因。对敌害生物应“以防为主,防治结合”,尽可能减少其危害。预防措施预防应贯穿在藻类培养过程的各个环节。 首先,力求藻种及营养盐的纯度,控制源头污染; 其次,海水须经严格过滤消毒,器具及藻类培养池也需严格消毒,同时加大接种比例,抑制其他杂藻及敌害生物的繁殖,减少藻液被污染的可能性; 再则,在日常管理中,保持藻类室的干净卫生,以防灰尘及昆虫等的污染。 消除、抑制或杀灭敌害生物方法: 一是使用过滤方法清除大型敌害生物。单胞藻都很小,对污染的大型敌害生物(如轮虫等),可以用过滤方法清除。通常清除轮虫可用网孔小于60微米的筛绢过滤,经一次过滤可以清除轮虫的成体,而轮虫卵和正在发育的幼小个体不能完全清除,所以必须连续过滤3天,每天1次。待第一次过滤后存留下来的卵和幼小个体发育成长为成体后,在第二次或第三次过滤时清除掉。 二是使用药物抑制或杀灭敌害生物。用于抑制或杀灭敌害生物的药物,有化学药品和中草药两大类。但往往由于敌害生物对药物的抵抗力比培养藻类强,效果不理想。目前,有效的药物方法还不多,药物杀灭敌害生物虽然取得一些初步效果,但还需进一步试验。 三是改变环境条件杀灭敌害生物。使用此法必须了解培养的藻类和敌害生物对生态因子的适应范围,然后根据具体情况,改变某一环境因素,达到杀灭敌害生物而又保存培养藻类的目的。…

贝类单胞藻培养技术

贝类育苗中,常用的单胞藻有角毛藻、新月菱形藻、三角褐指藻、金藻、扁毛藻、小球藻、微球藻等。     一、角毛藻、新月菱形藻、三角褐指藻   角毛藻、新月菱形藻、三角褐指藻都属硅藻门。角毛藻又有多种,常用的主要是牟氏角毛藻。牟氏角毛藻属广温广盐性藻类,在我国南方和北方均能培养,在水温处于28℃~30℃,盐度为30‰左右的条件下生长最快,将硅藻培养液配方作为其培养液配方即可,若适量多加一些硅,其生长速度会有明显提高。而光照强度应根据不同的级别培养和不同的藻种浓度进行调节,如一、二级培养中应避免直射光,光照不能太强,三级培养刚接种时弱光照射较好,当浓度较大时可用直射强光照射,同时可适当增加光照时间,一般可延长2~3个小时。在一、二级培养时,光照过强时间过长或温度超过30℃时易使藻种变绿,此时,应严格控制光照强度、光照时间、温度,必要时可降低培养液的盐度,使其恢复正常。新月菱形藻、三角褐指藻适合生长的温度为15℃~20℃,超过28℃会死亡。不过,笔者曾将它们和金藻3011混合培养在31℃时也可以生长,其浓度达60万/ml。   二、金藻   养殖贝类常用的金藻有金藻3011、湛江叉鞭金藻、等鞭金藻,其适温较广,最适温度为28℃~30℃,最适盐度为25‰~32‰。金藻培养时应加入适量的维生素和铁以提高其生长速度,在三级培养时,原生动物繁殖极快,当在100倍显微镜下观察到每个视野有2个以上原生动物时,藻液可在2天内变成清水。因此,我们应对用水、工具、培养池等严格消毒,并每天对藻种进行镜检,对有少量污染的金藻及时投喂,对污染严重不能用的金藻应先消灭原生动物后方可排掉,以防对其它池造成污染。   三、小球藻和微球藻   小球藻、微球藻属绿藻门,绿藻纲,属广温、广盐性藻类。其本身具有抗污染特性,极易培养,在三级培养时,所用水可以不用消毒,用300目筛绢过滤即可,只是应定期加入培养液以防老化,对污染严重的小球藻和微球藻可用一定浓度的漂白精对藻种进行消毒,杀灭其原生动物,待原生动物杀死后再用硫代硫酸钠还原,两天后即可恢复正常。近几年来,由于海水养殖业的大量兴起,海水的水质变化很大,特别是海水中的硅藻含量增加,给绿藻类的培养带来很大难度。笔者在海南省水产研究所培养小球藻、微球藻过程中,碰到几次当藻种浓度很高时藻液在1小时内快速变红的现象,既使对用水严格消毒也没效果,这种现象一般出现在每年的7月~9月,此时加入一定量的牙胞杆菌可使其恢复正常。   四、扁藻   扁藻属绿藻门、绿藻纲,扁藻属,也是极易培养的藻种之一,此藻种对铁元素吸收量也较大,应及时补充铁元素以加速其生长。在扁藻较高浓度时还可通过加入一定浓度的药物对其提纯、浓缩,低温保藏,有需要时,可加入培养液再次培养。   五、在贝类藻种培养时还应注意以下几点:   1、对用水、肥料、工具、培养池进行严格消毒。   2、根据各海区海水的肥瘦添加适量的营养盐,加入低浓度营养盐可缩短藻类细胞的停滞期,后期追加营养盐可保持其指数生长期。   3、及时调节光照、盐度、温度。根据藻种的不同浓度及时调整光照强度、光照时间,浓度较大时,可增强光照强度,延长光照时间,对易发生藻种变异的藻类,在一级培养时调整其生长盐度和温度是非常必要的。   4、根据不同的藻种用不同的药物控制污染并待藻种浓度高时适时进行浓缩、保藏以备不时之需。   5、一级培养时,尽可能在每次扩种时,根据藻种的上浮、聚光特性进行宏观提纯,以保证藻种的纯度和活性。…