单细胞藻种质分离、培养和应用

第一章 藻种的分离技术

第一节 采样方法

水样可以取自任何有可能生长所需单胞藻的水体,通常在海岸边退潮后留下的小水洼中或者在养殖场、盐场等地方的小水坑中,生长有适合静水培养的单胞藻类,而且比较纯。在实验场、育苗场的一些水池、水桶中都有可能出现比较纯的藻类。采样时要同时测定水样的温度和盐度,供分离、培养时参考。

水样采回后,进行现微镜检查,如果需要分离的藻类比较多,可以立即进行分离。如果在水样中有需要的藻类,但是数量不多,就要进行预培养,待其繁殖起来后再分离。预培养可以用500ml的三角烧瓶,加入150ml的培养液,然后把经350目筛绢过滤的水样150ml接种进去,在一定的温度和光照下静止培养,每天摇动1~2次。用作预培养的培养液,可选择各类藻类通用的培养液配方或者同时采用几种不同藻类的培养液同时分别培养。预培养的培养液的浓度应小些,一般只用原配方的1/2或1/4。如果要分离的藻类的最适生长条件是已知的,那就在其最适的光照和温度下培养。如果不知其最适生长条件,那就在人为设定的条件下培养,以便适应应用时的特定环境。

第二节 分离方法

一、微吸管分离法

用直径0.5厘米、长35厘米的普通玻璃管,在中央部分加热,拉长6~10厘米,使玻璃管的直径缩小至0.06~0.1厘米,把它折断后即成二个吸管。把一团棉絮塞进吸管的宽大一端,然后放入高压灭菌器中消毒。消毒后,再在酒精灯上加热吸管的细端,用镊子拉成极细的微管,直径缩小至0.08~0.16毫米即可。微吸管在入水的瞬间,因毛细管的作用会吸入微量的水。将藻液水样放在凹玻片上,在显微镜下用微吸管仔细地吸出单个藻体,滴在载玻片上,在显微镜下确认是所要分离的单个藻体后,移入经灭菌的培养液中培养。

二、平板分离法

按所要分离的藻类的特性,选用合适的培养液,在培养液中加入1~1.5%的琼脂,加热将琼脂溶化。加热后要加淡水补充蒸发掉的水分。然后,按照微生物学中固体培养基的制作方法倒平板、灭菌。

在无菌操作箱中,用接种针蘸取少量藻液,在固体培养基上划蛇形线,藻细胞就会散布在琼脂培养基的表面。

另一种使藻细胞散布在培养基表面的方法是用医用口腔喷雾器,将经稀释的藻液喷在培养基的表面。

将接种好的培养皿放在有适合的光照和温度的地方培养。一般经过十来天的培养就会在培养基上长出相互间隔的藻落。通过显微镜检查,找出所要的纯的藻落,再用已消毒的接种针从培养基上挑取藻体,移入经灭菌的培养液中培养。

三、水滴分离法

先将欲分离的藻液稀释,用微吸管将少量藻液吸出,滴在载玻片上,每张载玻片上可以滴数滴。水滴大小以在低倍显微镜下一个视野能包括整个水滴为准。在显微镜下逐个观察水样,挑选水滴中只有所要分离的单个藻体,而没有其他任何杂藻或小动物的,移入经灭菌的培养液中培养。

四、稀释分离法

用已消毒的试管5支,在第一支试管中加蒸馏水10毫升,第二和第五支试管都加5毫升,用高压蒸汽消毒,待冷却后,在第一支试管中滴入混合藻液1滴,充分震荡,使其均匀稀释。再用经消毒的吸管从第一支吸管中吸取5毫升到第二支吸管中,充分震荡后再取5毫升到第三支试管中,如此直至第五个试管。再取5个已装有消毒的培养基的培养皿,加热使培养基熔化,待冷却而尚未凝固时,分别滴入5个试管中的藻液各1滴,用力震荡,使藻液充分混入培养基中。等冷凝后将培养皿放在适合的条件下,直到培养基中出现藻落。在稀释适当的培养皿内,藻落和细菌群落会充分分离。再在无菌条件下将选取单个藻落接种到固体培养基的表面,再培养。重复数次,直至得到纯的藻落。

第二章 藻种的保存技术

保存藻种时可以根据保种目的和保种条件的不同分别采取不同的保种方法。

第一节 固体培养基保存法

此法通常把藻种接种在固体培养基上,在弱光低温条件下保存,接种一次可以保存半年到一年。

保种用的固体培养基的营养浓度应比正常的液体培养液的高,一般增加一倍。琼脂量为1~1.5%。保种用的培养容器可用三角烧瓶、试管和克氏扁瓶。固体培养基分装灭菌后,冷却待用。

将无污染的藻种用喷雾法或划线法接种到固体培养基上,在弱光条件下,让细胞在培养基上慢慢地生长繁殖,可保存半年到一年。

可进行低温保存的藻种,最好在低温环境中保存。接种后,首先放在光线充足的地方(防止直射光照射),使藻类细胞较快速地繁殖起来,直到培养基上出现颜色,即可放入冰箱或冷库中,一般在5℃左右的低温下保存。当然,不同的藻种保存的温度也不尽相同。每天应给藻种几个小时的弱光照。此法保存的时间可长达2至3年。如新月菱形藻可保存34个月,三角褐指藻可保存25个月,角毛藻和骨条藻可保存9个月。

第二节循环移养保存法

此法采用的容器一般为三角烧瓶(300毫升、500毫升、1000毫升等)和细口瓶(10000毫升、20000毫升等),将容器、工具消毒后,加入正常浓度的培养液,接种后瓶口用消毒的滤纸包扎,放在适宜的温度和光照条件下培养。白天摇动瓶子数次。一般5~10天即可移样一次。此法简单、容易掌握,而且保存的藻种活力强、纯度高、数量大。

资源来自:中国科学院海洋研究所海洋生物种质库

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