甲藻是水生生态系统中一类极其重要的单细胞真核生物，既是主要的初级生产者，也是赤潮的主要肇事者。准确鉴定甲藻物种是研究其生态功能、预警有害藻华及应对水产养殖灾害的基础。本手册系统阐述了甲藻鉴定的标准化流程、关键技术要点及常见误区，旨在提升鉴定工作的准确性与效率。

 一、 鉴定工作的目的与意义

甲藻鉴定并非简单的形态描述，其根本目的在于：

1.  物种精准识别：区分有益种与有害种（如产毒甲藻），为环境评估和风险管理提供依据。

2.  生态功能解析：明确不同物种在物质循环和能量流动中的角色。

3.  赤潮监测与预警：实现对关键致灾种的早期识别和动态监控。

4.  分类学与进化研究：为甲藻的生物多样性和系统发育研究提供基础数据。

 二、 鉴定流程：一套多层次、相互验证的系统

规范的鉴定应遵循“由宏观到微观，由形态到分子”的逐级验证原则。其核心流程如下图所示：

阶段一：样本采集与预处理

此阶段是保证后续鉴定结果可靠性的关键。

1.  采样：

    工具：使用采水器（如尼斯金瓶）于特定水层采集，或使用浮游生物网（常用20μm孔径）进行垂直或水平拖网。

    记录：必须详细记录采样时间、地点、经纬度、水温、盐度、pH、营养盐等环境参数。

    代表性：对于不均匀水体，应设置多个采样点混合，以保证样本的代表性。

2.  固定与保存：

    形态学鉴定：推荐使用鲁哥氏碘液固定。碘液能使甲藻的细胞结构和鞭毛着色，便于观察。固定比例为样本体积的1%（终浓度）。注意：碘液会褪色，固定后样本需避光保存，并尽快观察。

    分子生物学鉴定：绝对不能使用碘液或福尔马林固定，它们会严重破坏DNA。应使用：

        95%-100%乙醇：样本与乙醇体积比为1:3-1:5。

        冷冻保存：-20℃短期，-80℃或液氮长期保存。

    最佳实践：同一份样本应同时分装，一份用碘液固定用于形态观察，一份用乙醇或冷冻用于分子分析。

阶段二：形态学鉴定

这是最基础、最快速的鉴定方法，但高度依赖鉴定者的经验。

1.  标本处理：可进行适当浓缩（沉淀法或离心法）。对于网采样本，需注意细胞可能被挤压损坏。

2.  光学显微镜观察：

    活体观察：观察运动方式、形态变化是重要辅助特征。

    关键形态特征：

        细胞形状与大小：球形、椭圆形、纺锤形等；大小是重要参数。

        板片形态学：这是甲藻鉴定的“金标准”。需清晰观察并绘制壳板图。

            顶沟/横沟/纵沟：注意其位置、深度、旋绕程度。

            板片数目、形状、排列方式：使用符号法（如Po, cp, X‘, 4’, 6‘’, 5‘’‘, 2’‘’‘）进行记录。这是区分属、种的核心依据。

        细胞壁 ornamentation：有点状、网状、刺状等纹饰。

        色素体：颜色、形态、数量。

        细胞核：位置和形态。

        特殊结构：如甲藻丝状体、刺胞、淀粉核等。

3.  荧光显微技术：

    钙荧光白染色：该染料能特异性地与甲藻细胞板片内的纤维素结合，在荧光显微镜下清晰显示出板片的接合线，是观察板片结构的利器。

    表荧光显微镜：利用叶绿素的自发荧光，快速识别具有光合作用的甲藻。

阶段三：分子生物学鉴定

当形态学特征模糊、存在隐种或需精确确认时，分子鉴定是必不可少的手段。

1.  DNA提取：使用商业化的植物/真菌基因组DNA提取试剂盒，或CTAB法。

2.  基因标记选择：

    核糖体DNA：是最常用的条形码区域。

        LSU rDNA：特别是D1-D2区域，变异率适中，是区分属和种的首选标记。

        SSU rDNA：保守性较高，适用于更高阶元（科、目）的分类。

        ITS：内部转录间隔区，变异率最高，适用于种内和近缘种的区分。

    线粒体基因：如*cox1*（细胞色素c氧化酶亚基I），在动物中常用，但在甲藻中引物通用性较差，需谨慎使用。

3.  流程：PCR扩增 → 琼脂糖凝胶电泳检测 → 纯化 → 测序 → 序列比对。

    数据库：将所得序列在GenBank 和 PR² 等专业数据库进行BLAST比对。

    系统发育分析：对于新记录种或疑难种，需下载近缘种的序列，构建系统发育树（如ML, BI法），从进化关系上确认其分类地位。

 三、 关键注意事项与常见误区

1.  形态可塑性：同一物种在不同生长阶段、环境条件下形态可能有差异，切勿仅凭单一细胞特征下定论。

2.  固定剂的选择：混淆形态学和分子样本的固定剂是初学者最易犯的错误，务必分装处理。

3.  板片观察的难度：并非所有甲藻的板片都能在光学显微镜下清晰分辨，尤其是一些薄壁物种。此时钙荧光白染色至关重要。

4.  隐存多样性：许多形态相似的甲藻实为不同的物种（隐种），必须依靠分子数据才能准确区分。

5.  数据库的局限性：GenBank等数据库中存在错误标注的序列，比对结果需结合形态学特征进行批判性评估。理想的做法是将自己鉴定的物种序列（来自经形态学确认的标本）提交至数据库，贡献于公共知识库。

6.  综合鉴定原则：没有一种方法是万能的。最可靠的鉴定结果是形态学、分子生物学和生态学数据的综合体现。

 四、 结论

甲藻鉴定是一项综合性强的技术工作。成功的鉴定依赖于严谨的采样流程、多技术手段的交叉验证以及鉴定者对分类学知识的深刻理解。遵循本手册所述的流程，建立“形态+分子”的整合鉴定思维，将极大提高甲藻物种识别的准确性和科学性，为相关研究与应用奠定坚实可靠的基础。